Hsu等將重組CD4-IgG(CD4-免疫球蛋白G)用四級串聯(lián)的帕耳帖組件冷卻至-60℃，用一架低溫顯微鏡觀察到了它的再結(jié)晶過程。他的觀察室也可以被抽成真空而用于冷凍干燥研究。
Willemer將多次由低溫顯微鏡獲得的照片與電阻測量的結(jié)果進行了比較，低溫顯微鏡的結(jié)構(gòu)如圖4-14所示。復(fù)雜產(chǎn)品的電阻測量有時很難解釋清楚。圖4-15所示的是某種病毒的低溫保護溶液的電阻-溫度曲線。冷卻到-10℃，部分溶液凍結(jié)，然后過冷到約-46℃，在-65℃左右時溶液結(jié)晶。在溶液復(fù)溫過程中，在-32.5℃左右時，電阻值變化迅速。用低溫顯微鏡獲得的照片顯示出，在-40℃時，已被干燥和冷凍的兩部分都呈現(xiàn)出均勻的組織結(jié)構(gòu)（如圖4-16）。而在-30℃時，這兩部分都呈現(xiàn)出了黑色和灰色混合的區(qū)域，這表明，一些冰已經(jīng)融化，并且擴散到了已干燥的部分。在這種情況下，通過改變CPA的濃度以及選擇一個最佳的冷卻速度，電阻測量可以認(rèn)為是一種比較迅速的研究不同CPA的影響的方法。最終選擇的濃度和冷卻速度的組合可以用低溫顯微鏡來測試。圖4-17所示的是在冷凍、熱處理過程中以及在干燥前，一種藥品在低溫顯微鏡下的結(jié)構(gòu)變化。圖4-17~圖4-19所示的是來自同一實驗中，同一樣品的不同部分以及在不同的實驗階段的細(xì)節(jié)照片。圖4-17中，(a)是快速冷卻過程中，約在-24℃時樣品的照片，(b)是第一次從-54℃加熱到約-36℃的照片，(c)是再次被冷卻到-54℃時的照片。在圖(a)中，大部分晶體（顏色較深處）均勻地分布在濃縮的非晶固體（顏色較亮處）中間。在圖(b)中，晶體有所生長，濃縮物中的水分也已經(jīng)結(jié)晶。在圖（c）中，晶體與玻璃狀雜質(zhì)的邊界清晰可見，特別是在圖中右上角更明顯。圖4-18所示的是在一些具有可比性的溫度下，樣品另外的一個部分，即靠近樣品邊界的顯微照片：(a)約在-23℃，(b)第一次加熱時，約在-30℃，(c)再次冷卻到-60℃。圖(b)中，晶體已有所生長，但其大致結(jié)構(gòu)沒有太大的變化，特別是在圖的左上角部分。在圖(c)中，晶體與玻璃狀物質(zhì)的邊界更加清晰。圖4-18所示的是樣品的第三部分：(a)冷卻到一65℃之后的照片，(b)熱處理后，再次冷卻到-60℃，然后在-40℃開始凍干。同樣，熱處理并未使整體結(jié)構(gòu)有所改變，但是晶體結(jié)構(gòu)更加清晰，這表明玻璃相和晶體之間的水分子已經(jīng)遷移到晶體中。圖4-17~圖4-19中的照片說明，快速冷卻不能使整個樣品的各個部分形成均勻的組織結(jié)構(gòu)，因為它會受到邊界效應(yīng)的影響。但是，在樣品的所有部分都觀察到了熱處理的影響。圖4-20所示的是，從冷卻結(jié)束溫度（-60℃)上升到開始干燥溫度（-42℃）時，不經(jīng)熱處理對晶體生長的影響。值得注意的是，在自動向低溫擱板上裝載產(chǎn)品時出現(xiàn)的現(xiàn)象。第一次裝載藥瓶中的產(chǎn)品與后來裝載的，例如2~3h后裝載的，產(chǎn)品有不同的結(jié)構(gòu)。
低溫顯微鏡研究的優(yōu)點是有可以顯示樣品組織結(jié)構(gòu)變化過程的照片，而且，凍結(jié)的產(chǎn)品可以在大多數(shù)的設(shè)備中被冷凍干燥。產(chǎn)品層很薄，因此可以被迅速冷凍。所以，產(chǎn)品在復(fù)溫和干燥過程中所表現(xiàn)出的性狀特征與快速冷凍過程的相一致。因為產(chǎn)品層很薄，故模擬熱處理的過程很困難。然而，實驗表明，從此項研究中獲得的臨界溫度是有價值的，特別是獲得冷凍速率相對緩慢時產(chǎn)品的電阻值。
Nunnerf使用一臺特殊的低溫顯微鏡拍攝到了0.9%的NaCl溶液在360s內(nèi)直接冷凍到穩(wěn)定樹枝狀冰晶結(jié)構(gòu)的過程中冰晶邊界面變化的照片（如圖421）。在冰晶的表面可見因濃縮而集中起來的NaCI(黑色邊界)。
Cosman等人描述了一臺可以定量評價照片的低溫顯微鏡，該裝置有如下四個顯著特點：
①溫度的產(chǎn)生、測量和控制是由程序控制的;
②顯微照片可以存檔，以備后用；
③文檔可部分地用于自動圖像識別;
④如果冷凍過程可以用數(shù)學(xué)的方法描述，而且細(xì)胞的行為可以預(yù)測，則用上述方法可以減少數(shù)據(jù)量。
圖4-22表示的低溫顯微鏡系統(tǒng)的布置圖。通過使用熱傳導(dǎo)性非常優(yōu)良的藍(lán)寶石觀察窗和使用液氮冷卻系統(tǒng)，作者實現(xiàn)了以每分鐘幾百度的冷卻速率冷卻到一60℃，而且在溫度為0℃時，樣品內(nèi)的溫度梯度達(dá)到了0.1℃/mm。
下面用三個例子來說明使用這種顯微鏡系統(tǒng)如何進行冷凍過程的定量研究和存檔。圖4-23表示的是被分離的老鼠胰島細(xì)胞的體積與溫度的函數(shù)關(guān)系曲線。如圖4-24所示，細(xì)胞膜對水和CPA的滲透性的不同對細(xì)胞的冷凍是非常重要的。
將獼猴卵母細(xì)胞置入體積分?jǐn)?shù)10%的二甲基亞砜溶液(DMSO)后其體積幾乎減少到原來的三分之一，這是因為水能從細(xì)胞里擴散到周圍環(huán)境中去，而二甲基亞砜卻不能擴散到細(xì)胞內(nèi)（測量溫度為23℃）。
細(xì)胞損壞的原因在于細(xì)胞內(nèi)冰晶成核。圖4-25表示在不同冷卻速率下，有多少老鼠卵母細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)冰與溫度之間的函數(shù)關(guān)系曲線。老鼠肝細(xì)胞在以大約40℃/min的速率冷卻到-21℃的過程中沒有發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)冰，然而，當(dāng)以140℃/min速率冷卻時幾乎所有的細(xì)胞內(nèi)都存在冰，這是因為水沒有足夠的時間擴散到周圍環(huán)境就被凍結(jié)在細(xì)胞內(nèi)。圖4-25也說明細(xì)胞內(nèi)冰晶成核是由絕對溫度和冷卻速率決定的：在大約-25℃，以5℃/min速率冷卻幾乎所有的細(xì)胞內(nèi)都有冰，然而，以3.5℃/min速率冷卻，大約20%的細(xì)胞內(nèi)沒有冰。
Dawson和Hockley利用掃描電子顯微鏡(SEM)表明了海藻糖和甘露醇溶液的快速冷凍(150℃/min)和慢速冷凍(1℃/min)時結(jié)構(gòu)上的差異。圖4-26表示1%海藻糖溶液被(a)慢速和(b)快速冷凍時中心部位的表面結(jié)構(gòu)。慢速冷凍樣品（c）濃縮的固體表面上產(chǎn)生裂縫，然而，快速冷凍的樣品的結(jié)構(gòu)卻是均勻的纖維狀。圖4-27表示慢速和快速冷凍1%乳糖時其中心部位粗糙的(a)和精細(xì)的(b)結(jié)構(gòu)。在圖4-28(a)中可發(fā)現(xiàn)海藻糖溶流崩塌的部分，圖（b)表示干燥后產(chǎn)品在潮濕的環(huán)境下貯存6個月以后的結(jié)構(gòu)，圖片表明不同的冷凍速率導(dǎo)致不同的結(jié)構(gòu)，且有可能使固體濃縮在表面上，在干操過程使干燥速率降低，殘余水分含量增加。
